传统发酵豆腐酸浆中高产酸乳酸菌的分离鉴定及特性分析（一）

酸浆豆腐是传统产酸我国特色的传统食品，其制作的发酵分离独特之处在于用酸浆代替传统的盐卤和石膏作为凝固剂。酸浆豆腐一直依靠工人多年经验进行生产的豆腐小作坊制作方式，先将酸浆老汤加入黄浆水，酸浆其中的中高乳酸菌在常温下将黄浆水自然发酵为酸浆，再使用酸浆作为酸性凝固剂，乳酸通过点浆使豆浆凝固制成酸浆豆腐。菌的鉴定及特酸浆豆腐口感细腻，性分析风味独特，传统产酸在我国山东等地已经作为特色食品被列入“非物质文化遗产”。发酵分离然而手工作坊式的豆腐生产方式具有酸浆质量无法保障，生产效率低，酸浆货架期不稳定等缺点。中高为了实现酸浆豆腐的乳酸工业化生产，促进我国传统食品的菌的鉴定及特“食文化”广泛传播，对酸浆中的乳酸菌进行分离筛选，发掘产酸能力强的菌株井探究其性质，为今后酸浆豆腐的工业化生产打下基础。

部分学者对豆腐酸浆中的微生物开展了初步探索，乔支红等利用从豆腐酸浆老汤中筛选到的5株产酸菌发酵大豆黄浆水，以酸浆的pH值为考察指标，探讨了单菌发酵、双菌发酵、发酵温度、菌种接种量及菌种的混合比例对酸浆pH值的影响，结果表明，酸浆纯种发酵的最佳工艺参数为双菌混合发酵，混合比例1∶9（1号菌∶3号菌），接种量5%，发酵时间24h，发酵温度42℃；贺云等从云南牟定地区的10份自然发酵酸浆豆腐中分离筛选得到6种乳酸菌，并分别鉴定为类布氏乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、德式乳杆菌和粘膜乳杆菌，其中植物乳杆菌产酸能力最强；刘倩等从豆清发酵液中分离纯化出3株产酸菌，经生理生化和16SrRNA基因序列分析鉴定该菌株为产酸解淀粉乳杆菌。但现有研究局限于单一产地，缺乏对全国酸浆菌种差异的整体研究。

本研究从云南建水、陕西榆林、山东邹平、河北涞源、云南石屏以及北京延庆6个国内具有代表性的酸浆豆腐产地中的7种豆腐酸浆老汤中筛选分离各样品中的高产酸乳酸菌，通过形态观察及分子生物学技术进行鉴定，并对其产酸能力、耐酸性、耐盐性等生长特性进行研究，旨在对全国主要酸浆豆腐产地中的产酸菌构成及特性进行探究，为酸浆中优质乳酸菌生物资源的筛选以及后续酸浆生产工业化奠定基础、提供科学依据。

一、材料与方法

1、材料与试剂

（1）材料

豆腐酸浆老汤：云南建水、陕西榆林、山东邹平、河北涞源、云南石屏以及北京延庆的酸浆豆腐加工作坊。

（2）培养基

黄浆水培养基：为豆腐压滤成型后的黄色沥水，取自北京延庆豆腐厂。MRS肉汤培养基、MRS固体培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。以上培养基在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min。

（3）化学试剂

葡萄糖、无水碳酸钙、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；二甲基亚砜（色谱纯）：北京博奥拓达公司；细菌基因组脱氧核糖核酸提取试剂盒、回收试剂盒、DL3000DNAMarker、TransTaq-TDNAPoly-merase（250U）、10×TransTaq-TBuffer、2.5mmol／L脱氧核糖核苷三磷酸、6×DNALoadingBuffer：美国TransTaq公司。

2、仪器与设备

YP20001电子大平：上海雷韵实验仪器制造有限公司；PHS-3CpH计：匕海精密科学仪器有限公司；DL-CJ-2ND型超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；YQX-SG46-280S自动高压灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TENSUC恒温培养箱：匕海大呈实验仪器制造有限公司；TU-1900紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；TGL-16aR高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；1260series高效液相色谱仪：美国Agilent科技有限公司；T1000聚合酶链式反应仪：美国Bio-Rad公司。

3、实验方法

（1）酸浆增殖培养

酸浆的活化与增殖培养采用乔支红等的方法。取5mL酸浆接种于20mL黄浆水培养基中，在37℃恒温培养箱中静置培养48h。

（2）产酸菌株的分离纯化

将增殖培养的酸浆经无菌生理盐水梯度稀释至10^-4、10^-5、10^-6三个梯度，取100μL梯度稀释液于空白培养皿中，倒入融化井冷却至45℃左右的含有2%CaCO3的MRS肉汤培养基，于37℃恒温培养箱中倒置培养48h。挑取产生溶钙圈的菌落于MRS固体培养基反复划线分离直至出现单菌落，镜检后选取符合乳酸菌形态、无杂菌的菌落接种于MRS斜面培养基于4℃保存。

（3）高产酸菌株的筛选

将每个样品中分离纯化得到的乳酸菌活化后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温静置培养24h，测定培养基pH值，选取每个样品中pH值最低的菌株为该样品中高产酸菌株。

（4）菌株的分子生物学鉴定

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取筛选菌株的基因组DNA，以其为模板对菌株的16SrDNA进行PCR扩增。PCR扩增引物为16SrDNA通用引物1492R、27F；PCR扩增体系：10×buffer5μL，10×TransTaq-T0.5μL，引物27F1μL，引物1492R1μL，DNA模板1μL，dNTPs4μL。PCR扩增程序：预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，29个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片段。将PCR扩增产物用回收试剂盒回收，使用测序仪对PCR扩增产物进行测序。

将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心的Genbank数据库中进行基本局部比对搜索工具比对，选取同源性较高的模式菌株的16SrDNA序列，采用MEGA-X10.1软件中的邻接法构建系统发育树。

（5）产酸量测定

将活化后的菌种按2%（V／V）的接种量接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温静置培养。取样时间间隔为前12h每隔2h取样测定；12h后每隔4h取样测定；24h后每隔12h取样测定。发酵液经蒸馏水稀释10倍后，滴加5滴酚酞溶液，用0.1mol／L氢氧化钠溶液滴定至粉红色出现，且30s后不褪色即为滴定终点，记录NaOH消耗体积，三组平行。以灭菌后的MRS肉汤培养基作为空白对照，计算产酸量，其计算公式如下：

X=（V₁-V₂）×C_NaOH×0.09×100／V_样品X为样品产酸量（以乳酸计），g／100mL；V₁为样品消耗氢氧化钠溶液体积，mL；V₂为空白培养基消耗氢氧化钠溶液体积，mL；C_NaOH为标定的氢氧化钠浓度，g／L；0.09为乳酸的换算系数。

（6）有机酸组成分析

将活化后的菌种接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温静置培养12h。采用高效液相色谱（HPLC）进行有机酸组成分析。液相色谱条件：色谱柱为CarbomixH-NP10：8%（10μm，7.8×300mm）；流动相为20mmol／LNaH2PO4；进样体积为10μL；流速为1.0mL／min；柱温为30℃；检测波长为210nm。

（7）耐酸性测定

以自然pH值的MRS肉汤培养基（pH6.83）作为空白对照，将预先活化好的菌株按2%（V／V）的接种量分别接种于pH值为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的培养基中，37℃静置培养48h，采用分光光度计在波长600nm处测定其OD_600nm值。

（8）耐盐性测定

将预先活化好的菌株按2%（V／V）的接种量接种于盐浓度分别为0、1%、2%、3%、4%、5%的MRS肉汤培养基中，37℃静置培养48h，测定其OD_600nm值。

（9）数据处理

利用Excel与SPSS18.0软件对数据进行分析处理，使用MEGA-X10.1软件构建系统发育树。

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